直接獲取生物組織內部磷脂類物質的質譜分析方法論文
1引言
磷脂類物質及其代謝物具有重要的生理功能，在細胞生長分化、凋亡吞噬、能量儲存、信號傳遞等生理過程起到重要作用。磷脂作為細胞膜的主要組成成分，在細胞中的含量相對較高，是單細胞領域研究備受關注的物質之一。由于很多疾病的發(fā)生、發(fā)展都與體內磷脂類物質含量的變化、代謝紊亂等密切相關，可作為一些疾病的生物標記物。因此，盡可能全面地得到生物組織樣品中磷脂類物質信息’對揭示其在生命體內的作用機制、尋找疾病的分子標志物及醫(yī)藥研發(fā)等方面具有重要意義。
然而，由于磷脂類物質種類繁多，相互作用復雜，傳統(tǒng)的分析技術檢測復雜樣品（如血漿、組織）中磷脂類物質時，一般都要經(jīng)過分離、純化、提取等復雜的樣品預處理過程不僅耗時較長，而且可能帶來不確定因素。直接質譜分析技術，如電噴霧解吸電離（DESI)、激光消融電噴霧電離（LAE-SI)等，因其無需樣品預處理、樣品耗量少、響應速度快、靈敏度高等，可實現(xiàn)生物組織樣品中多種磷脂類物質的同時、直接、快速識別。這些方法主要分析組織樣品表面的磷脂，無法實現(xiàn)對整體組織樣品內部磷脂的直接檢測。
內部萃取電噴霧電離質譜(iEESI-MS)技術直接將萃取劑導人到組織樣品內部’可實現(xiàn)組織樣品內部小分子代謝產(chǎn)物等組分的直接質譜分析。本研究采用iEESI-MS技術，在無需樣品預處理的條件下，考察了21種不同組成的CH3OH-H2O溶劑體系，獲得。％0仏％0(30:70,V/V)為適合不同生物組織樣品中磷脂類物質分析的最佳溶劑’建立了一種無需破壞、研磨即可獲取生物組織樣品內部磷脂類物質的質譜學新方法。
2實驗部分
2.1儀器與試劑
內部萃取電噴霧電離源（iEESI)為本實驗室自制；LTQ-XL線性離子阱質譜儀并配有Xcalibur數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國ThermoScientific公司）；質譜儀設置在正離子檢測模式下，質量掃描范圍為m/z50~2000,離子源電壓5.5kV,離子傳輸管溫度為150T，毛細管電壓為10V，透鏡電壓為100V;在進行串聯(lián)質譜分析時，設置碰撞能量為10?30%,碰撞時間為30ms,母離子隔離寬度為1.5Da;其它檢測參數(shù)由LTQ-Tune系統(tǒng)自動優(yōu)化得到。石英毛細管（內徑0.10mm，外徑0.19mm，美國AgilentTech?nologies公司）;甲醇(色譜純，美國ROE公司）,實驗用水為二次蒸餾水。
2.2實驗方法
iEESI-MS的實施方式如圖1所示。將石英毛細管平行插人組織樣品內部，插人組織樣品內部的石英毛細管前端距離樣品前沿約2mm,樣品前端與質譜人口的距離為5?6mm，萃取溶劑以0.5^L/min的流速通過石英毛細管，流經(jīng)組織樣品內部并在
組織樣品內部進行選擇性萃取。在微量進樣針的鋼針部位施加5.5kV正高壓，在電場的作用下，樣品前端產(chǎn)生大量承載待測物的微小帶電液滴。這些微小帶電液滴去溶劑化后得到氣態(tài)待測物離子，引人質譜儀檢測。
本研究所用實驗樣品人體肺癌組織（包括癌意圖癥組織與癌旁組織（距離癌癥組織中心約5cm))Fig.1SchematicdiagramofinternalextractiveelectrosPray和食管癌組織由南昌大學第二附屬醫(yī)院提供，其iTOiZatiTO(iEESI)maSSSpectr0metry它組織樣品，如豬肺、豬肉、牛肉、豬心等，購自當?shù)厥袌觥Ｋ袠悠肪鶅Υ嬗?80°C超低溫冰箱中，在進行iEESI-MS分析前，將樣品取出室溫下解凍，樣品無需其它處理，即可直接進行iEESI-MS實驗。在優(yōu)化實驗中，以不同體積比的CH3OH-H2O萃取每種樣品，平行檢測至少3次，確保實驗結果的重復性。
3結果與討論
3.1萃取溶劑優(yōu)化
為了全面獲取組織樣品中磷脂類物質信息，選擇合適的萃取溶劑對提高分析方法的性能具有重要意義。目前，最常用的脂類物質萃取方法是傳統(tǒng)的“金標準”法，即Folchorblighanddyerrecipes法。該方法采用CHClg-C^OHGa，V/V)混合液為萃取溶劑，但氯仿具有致癌性，且降解產(chǎn)生光氣、氯化氫氣體，可能使一些不穩(wěn)定磷脂類物質發(fā)生化學修飾，影響檢測結果的準確性。有文獻報道，改進的二氯甲烷-甲醇（C%%-CH3OH)、甲基叔丁酰乙醚-甲醇（MTBE-CH3OH)[1]等可用于組織樣品中脂類物質的提取，但這些體系均不適于質譜進行直接檢測。顯然，在質譜分析中，萃取劑既是該待測物的電噴霧液滴，也是影響物質萃取效率的重要參數(shù)，不僅所選溶劑本身的化學及物理性質在一定程度上影響獲得的分子信息，而且目標物離子化效率受到溶劑組成和其本身在溶劑中溶解度的影響，相似相溶的規(guī)律依然適用。
實驗選用不同體積比的C^OH-H2O(0?100%)為萃取溶劑，選擇肺癌患者的癌癥與癌旁組織為實驗樣品，按2.2節(jié)實驗方法測定組織樣品中的磷脂類物質，每個比例至少測3次，萃取劑中CH3OH含量對癌癥組織(CA)(圖2a)與癌旁組織（CAB)(圖2b)中二棕櫚酰磷脂酰膽堿(m/z757，[DPPC+Na]+)、1-棕櫚酰基-2-油酰基磷脂酰膽堿（m/z783，[POPC+Na]+)、二油酰磷脂酰膽堿（m/z809，[DOPC+Na]+)和花生四烯酰-硬脂磷脂酰膽堿（m/z833，[SAPC+Na]+)的信號強度的影響如圖2所示。
在癌癥組織（圖2a)中，當C^OH含量在0?15%范圍時，這4種磷脂類物質的信號強度隨CH3OH含量的增加而逐漸下降;當CH3OH含量在15%?30%范圍時，癌癥組織中這4種磷脂類物質的信號強度隨CH3OH含量的增加而逐漸增大;當CH3OH含量在30%?40%范圍時，它們的信號強度隨C&OH含量的增加而逐漸下降;當CH3OH含量在35%?75%范圍時，這4種磷脂類物質的信號強度不再隨C^OH含量的增大發(fā)生明顯的變化;當C^OH含量達到80%時，這4種物質的信號強度又開始增大。總體來說，CH3OH含量為30%時，這4種磷脂類物質的信號強度最高；當C^OH含量大于80%后，它們的信號強度先下降后趨于穩(wěn)定。
在癌旁組織（圖2b)中，當CH3OH含量在0?30%范圍時，隨CH3OH含量增加，除m/z757([DPPC+Na]+)的信號強度變化趨勢不穩(wěn)定外，m/z783([POPC+Na]+)、m/z809([DOPC+Na]+)
和m/z833([SAPC+Na]+)這3種磷脂類物質的信號強度基本都逐漸增大;當CH3OH含量在35%時，這4種磷脂類物質的信號強度明顯下降;當CH#H含量在40%?70%范圍時，這4種磷脂類物質的信號強度不再隨CH3OH含量的增大發(fā)生明顯的變化；當CH3OH含量達到75%時，這4種物質的信號強度又開始增大。但總體來說，CH，OH含量為30%時，這4種磷脂類物質的信號強度最高；當CH，OH含量大于75%后，它們的信號強度先下降后趨于穩(wěn)定。綜合考慮，選擇CH3OH-H#(30:70，V/V)為癌旁與癌癥組織中磷脂類物質的最佳萃取體系。
上述結果表明，待測物在iEESI源中的電離效率可能與它在萃取劑中的溶解度、萃取劑極性及其本身極性等密切相關。因此，iEESI方法可通過選擇合適的萃取溶劑提高方法的靈敏度和選擇性。
3.2癌癥組織樣品分析
選擇〔^^只：^。。。:？。，V/V)作萃取溶劑，獲取了肺癌組織（圖3a)、肺癌旁組織（圖3b)與食管癌組織（圖3c)的iEESI-MS化學指紋譜圖。通過進行碰撞誘導解離實驗（CID)和相關文獻比較證實，這3種組織樣品在m/z700-900質量范圍內主要得到磷脂類物質，如m/z757[PC(32：0)+Na]+，m/z773[PC(32：0)+K]+，m/z783[PC(36:4)+Na]+，m/z799[PC(36:4)+K]+，m/z809[PC(36:2)+Na]+，m/z825[PC(36：2)+K]+和m/z833[PC(38：4)+Na]+等。
從肺癌癌癥組織譜圖（圖3a)可見，m/z783[PC(36：4)+Na]+，m/z799[PC(36：4)+K]+，m/z809[PC(36：2)+Na]+，m/z825[PC(36：2)+K]+，m/z833[PC(38：4)+Na]+等在癌癥組織中的相對豐度明顯高于它們在癌旁組織中的相對豐度，而m/z757[PC(32：0)+Na]+在癌癥組織中的相對豐度卻低于它在癌旁組織中的相對豐度。有文獻報道，質譜信號峰如m/z757，783，809，833等都是肺表面活性物質（PS)的主要成分「171。肺表面活性物質（PS)是由構成肺泡壁的肺泡2型（AT2)細胞分泌，其成分主要包括磷脂類（DPPC占80%)和少量肺表面活性物質結合蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，AT2細胞基因突變可致肺癌[18]，家族性肺纖維化和肺癌與表面活性物質結合蛋白D(SP-D)[19]突變有關。有學者甚至提出血清中前表面活性物質結合蛋白B(pro-SP-B)是一種肺癌生物標志物的觀點「2()1。但目前PS代謝異常與AT2細胞突變成肺癌細胞的關系尚不明確，還有待于進一步研究。
此外，對比肺癌組織（圖3a)與食管癌組織（圖3c)的化學指紋譜圖可以看出，在較高質量范圍(m/z700?900)，雖然這兩種組織樣品都主要得到磷脂類物質，如m/z726，761，757，773，783，799，809，825等，但是，由于不同組織樣品之間的本體差異，得到的質譜信號峰表現(xiàn)出一定的區(qū)別。這主要表現(xiàn)在肺癌癌癥組織得到的磷脂類物質明顯比食管癌組織豐富。
磷脂類物質是細胞膜的主要成分，具有能量儲存、信號傳遞等重要作用。越來越多的研究表明，磷脂類物質可以作為癌癥診斷潛在的分子標志物[5];人類很多疾病的發(fā)生，都與其體內部分磷脂類物質含量的變化息息相關，例如磷脂類物質在心血管疾病中的作用已經(jīng)得到初步確認[21，22]。因此，建立一種快速、準確的分析生物組織樣品中磷脂類物質的方法，對尋找疾病分子標志物，進一步探究疾病的發(fā)病機制與磷脂類物質之間的關系具有重要意義。
3.3其它生物組織樣品分析
選擇CH3OH-H2O(30：70，V/V)作萃取溶劑，獲取了豬肉(圖4a)、牛肉（圖4b)、豬心（圖4c)、豬肺組織（圖4d)的iEESI-MS譜圖。從圖4可見，在m/z700?900質量范圍內，這幾種組織樣品均可得到磷脂類物質的質譜信號峰，如m/z757，773，783，799，809，825等，但是，由于不同組織之間存在本體差異，它們質譜信號峰也表現(xiàn)出一定的差別。此結果進一步說明，CH3OH-H:O(30:70，V/V)溶劑體系，不僅是分析人體癌癥組織樣品中磷脂類物質的最佳萃取劑，還適用于豬肉、牛肉、豬肺、豬心等動物組織樣品中磷脂類物質的直接質譜分析。本研究為生物組織樣品中磷脂類物質的分析提供了新思路。
4結論
本研究采用iEESI-MS技術，在無需樣品預處理的條件下，以磷脂類物質豐富、信號強度高為目標，考察了21種不同組成的CH3OH/H2O溶劑體系，確定CH3OH-H2O(30:70，V/V)為適合不同生物組織樣品中磷脂類物質分析的最佳溶劑，建立了一種無需破壞、研磨即可獲取生物組織內部樣品中磷脂類物質的質譜學新方法。同時進一步說明iEESI-MS方法可以通過選擇合適的萃取溶劑來提高方法的分析靈敏度和選擇性。
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