羅布麻葉頂空氣相色譜—質譜指紋圖譜的研究
【摘要】
【目的】建立羅布麻葉揮發性成分頂空氣相色譜—質譜（HSGC?MS）指紋圖譜分析方法,評價不同產地羅布麻葉藥材的質量。【方法】采用HSGC?MS聯用技術對不同產地羅布麻葉的揮發性成分進行分析,測定其指紋圖譜,確定共有指紋峰,并作模糊聚類分析和相似度評價。【結果】羅布麻葉揮發性成分中含有14個特征性指標成分,初步建立了以此14個共有峰為特征指紋信息的HSGC?MS指紋圖譜�！窘Y論】本方法準確可靠,重復性好,可作為羅布麻葉質量評價的依據。
【關鍵詞】 羅布麻葉/化學；揮發性成分/分析；指紋圖譜
羅布麻葉為《中國藥典》收載的常用中藥,系夾竹桃科植物羅布麻Apocynum venetom L.的干燥葉,具有平肝安神、清熱利水之功效［1］。現代用于治療高血壓、高血脂、冠心病、哮喘、氣管炎等疾病有較好的效果［2］。羅布麻葉揮發性成分為主要活性成分之一,如芳樟醇有鎮靜、降血壓、抗菌等作用［3］,薄荷酮和胡薄荷酮有解熱、鎮痛、抗炎作用［4］,藏紅花醛有較強的抗癌活性［5］,氧化石竹有平喘、鎮靜、抗癌作用,1?α?品醇有顯著平喘功效［6］,但尚未見有關羅布麻葉揮發油指紋圖譜研究的報道。本研究采用頂空氣相色譜—質譜（HSGC?MS）聯用技術對不同產地羅布麻葉的揮發性成分進行分析，現報道如下。
1儀器與試藥
Agilent 6890/5975B型氣—質聯用分析儀,G1701DAD.03.00.611工作站,Agilent G1888頂空自動進樣器(美國安捷倫儀器公司),NIST05標準質譜檢索庫。
羅布麻葉各產地樣品為實地采集或由當地藥材公司提供,編號為：S1?江西,S2?安徽,S3?吉林,S4?山東,S5?山西,S6?江蘇,S7?新疆,S8?河北,S9?內蒙古,S10?天津,S11?遼寧,S12?陜西。均經研究者鑒定為夾竹桃科植物羅布麻Apocynum venetom L.的葉。留樣憑證存放于南京中醫藥大學中藥鑒定實驗室。
2方法與結果
2.1分析條件
2.1.1色譜條件色譜柱：HP?5MS(涂布濃度為5%的苯甲基聚硅氧烷彈性石英毛細管柱,30.0 m×250 μm×0.25 μm)；進樣口溫度：180℃；程序升溫：50℃保持20 min,以4℃/min的速率升至200℃,保持5 min；載氣：He氣,流量：1.0 mL/min,分流比15∶1。
2.1.2質譜條件電離方式：電子轟擊離子源(EI)；離子源溫度：230℃,四級桿溫度：150℃,接口溫度：280℃；電子倍增器電壓：1 329.4 V；電子能量:70 eV；掃描范圍：45.0~650.0 aum。
2.2頂空供試品制備
通過對藥材粉碎粒度、體積裝樣量、頂空加熱溫度及頂空加熱時間進行考察,確定羅布麻葉揮發性成分優化的頂空條件：取羅布麻葉粉末(過40目篩)3 g,精密稱定,置頂空瓶中,密封,放入頂空進樣器,120℃加熱平衡30 min,供測試。
2.3方法學考察
2.3.12 h記錄圖取羅布麻葉揮發性成分進樣分析,結果表明：60～120 min無出峰,提示50 min內揮發性成分出峰完全。
2.3.2精密度試驗取羅布麻葉(S2)揮發性成分進行分析,連續進樣5次。結果表明：14個指標成分群保留時間的相對標準偏差均小于0.21%,相對含量的相對標準偏差均小于5%,提示儀器精密度良好。
2.3.3穩定性試驗取羅布麻葉(S2)揮發性成分進行分析,分別在1、3、6、24、48、120 h進樣6次,得14個主要特征峰保留時間、相對含量。結果表明：14個指標成分群保留時間相對標準偏差均小于0.29%,相對含量的相對標準偏差均小于5%,提示120 h內樣品(溶液)穩定性較好。
2.3.4重復性試驗取同一批次羅布麻葉(S2)5份,提取揮發性成分后分別進樣分析,得14個主要特征峰的保留時間和相對含量。結果表明：14個指標成分群保留時間的相對標準偏差為0%～1.37%,相對含量的相對標準偏差為1.83%～5.15%,說明重復性較好。
2.4指紋圖譜建立
樣品按選定的頂空條件及分析條件進行分析,測得所有供試品的氣相色譜—質譜（GC?MS）總離子流圖；再對總離子流圖中的各峰經質譜掃描后得質譜圖,所有組分質譜數據經計算機處理和NIST05標準質譜圖庫檢索鑒定,并與有關標準譜圖核對,初步確定出羅布麻葉揮發性成分中53種化合物。根據羅布麻葉揮發性成分HSGC?MS總離子流圖所給出的峰數高、峰保留時間和峰面積值等相關參數以及成分鑒定結果,進行分析、比較,制定HSGC?MS指紋圖譜(圖1，見彩圖頁第666頁)。
2.5指紋圖譜分析
2.5.1共有指紋峰的標定經對揮發性成分GC?MS總離子流圖的分析、比較,羅布麻葉標定14個共有峰作為指紋圖譜的特征峰,1～14號峰化學成分依次為：2?戊?1?醇、未鑒定、1,2,5,5?四甲基1,3?環戊二、3,5?二甲基苯酚、安息香醛、2?戊基呋喃、順式氧化芳樟醇、2,6?二甲基環己醇、薄荷酮、藏紅花醛、β?環檸檬醛、胡薄荷酮、大馬酮、5,6,7,7A?四氫?4,4,7a?三甲基(4H)?苯呋喃酮。以2?戊基呋喃(6號峰)為參照峰,分別求出各共有峰與之相比的α值(調整保留時間之比)和各共有峰的相對峰面積(峰面積之比)，見表1。表1羅布麻葉揮發性成分中共有峰的相對保留時間α值和相對峰面積（略）
2.5.2指紋圖譜的聚類分析選擇羅布麻葉揮發性成分中14個比較明顯的共有峰,根據表1中的數據,采用SPSS 15.0軟件中的hierarchical cluster analysis對12個羅布麻葉樣品進行聚類分析,所用聚類方法為average linkage (between groups),距離公式為square euclidean distance,得不同樣品羅布麻葉的聚類分析圖。
圖2結果顯示：當距離標尺在1時,樣品5、6、11,樣品1、3、10,樣品2、9各歸為一類；當距離標尺在2時,樣品5、6、11與樣品4、8歸為一類；當距離標尺在3時,樣品4、5、6、8、11與樣品1、3、10歸為一類,樣品2、9與樣品7歸為另一類；當距離標尺在8時,樣品1、3、4、5、6、8、10、11與樣品2、7、9歸為一類；當距離標尺在25時,樣品12才與樣品1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11即全部聚為一類。
2.5.3色譜峰的重疊率以羅布麻葉9號樣品圖譜為基準,按以下公式計算重疊率=［待測樣品與標準樣品共有的峰數×2/(待測樣品與標準樣品峰數和)］×100%。分別求得另外11種樣品色譜峰的重疊率依次為：64.0%、82.5%、72.7%、79.5%、78.9%、75.7%、76.3%、67.6%、64.7%、74.6%、92%。
2.5.4相似度評價將測試數據導入Excel表格,采用中位數夾角余弦法計算相似度,進行色譜峰差異性評價和整體相似性評價。各相似度值如下：S1?0.959、S2?0.925、S3?0.977、S4?0.986、S5?0.991、S6?0.957、S7?0.979、S8?0.963、S9?0.973、S10?0.987、S11?0.932、S12?0.888。結果顯示，羅布麻葉樣品指紋圖譜相似度較好,均在0.88以上。
3討論
揮發性成分頂空條件的優化：藥材粉碎粒度的考察結果表明,60目藥材粉末所得色譜峰峰數比40目、30目藥材峰數明顯減少,40目所得色譜峰數峰高較30目高,故粉碎粒度選擇40目藥材粉末。體積裝樣量的考察測定結果表明,1.5 g藥材所測出的色譜峰數較少,2 g藥材峰面積較小,3 g藥材測出的色譜峰較多,峰面積較大,故體積裝樣量選擇3 g。
頂空加熱溫度的考察測定結果表明,90℃和100℃加熱溫度下檢出色譜峰的峰數明顯減少,110℃和120℃加熱檢出的色譜峰中后者峰高較高,故樣品加熱溫度選擇120℃。頂空加熱時間的考察測定結果表明,4個不同加熱時間下的峰數相差不多,加熱30 min的峰高較高,故樣品加熱平衡時間選擇30 min。
不同產地羅布麻葉中均含有2?戊?1?醇、未鑒定、1,2,5,5?四甲基1,3?環戊二、3,5?二甲基苯酚、安息香醛、2?戊基呋喃、順式氧化芳樟醇、2,6?二甲基環己醇、薄荷酮、藏紅花醛、β?環檸檬醛、胡薄荷酮、大馬酮、5,6,7,7A?四氫?4,4,7a?三甲基(4H)?苯呋喃酮等14種主要成分,占揮發性總成分的60%左右,故以此14個特征性指標成分作為共有特征峰構建GC?MS指紋圖譜。
應用模糊聚類法分析比較,能揭示揮發性成分中特征性成分質量分數的配比關系,更能全面、綜合、準確地反映不同產地藥材GC?MS指紋圖譜的關系,本實驗初步建立了羅布麻葉揮發性成分GC?MS指紋圖譜分析方法,而且方法準確可靠，重復性好，為羅布麻藥材的質量評價和GAP實施提供了科學依據。
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