瘧原蟲抗藥性的遺傳學(xué)研究進展

瘧原蟲抗藥性的遺傳學(xué)研究進展

瘧原蟲抗藥性的遺傳學(xué)研究進展 關(guān)鍵詞：瘧原蟲屬；抗瘧藥；抗藥性；基因

　　摘　要　瘧原蟲產(chǎn)生抗藥性是瘧疾防治中遇到的主要難題之一。抗葉酸類抗瘧藥的抗藥性機制已基本搞清，與其作用靶酶二氫葉酸還原酶或二氫蝶酸合成酶基因點突變相關(guān)。喹類藥物抗性影響因子尚不完全清楚。惡性瘧原蟲5號染色體上的多藥耐藥基因1及7號染色體上的cg2基因可能是抗性相關(guān)基因，但二者都不能完全解釋抗性，尚待深入研究。
　　瘧疾的流行至今仍然十分廣泛，遍及全球90多個國家和地區(qū)，20億人面臨感染瘧疾的危險。據(jù)統(tǒng)計，全球每年有3億～5億瘧疾病例，導(dǎo)致150萬～270萬人死亡，其中100萬是居住在非洲的5歲以下兒童［1］。人類在長期實踐過程中篩選了大量防治瘧疾的藥物，但是，自從50年代末在東南亞和南美洲分別發(fā)現(xiàn)惡性瘧原蟲對氯喹產(chǎn)生抗藥性以后，抗氯喹惡性瘧迅速擴散蔓延，抗藥性程度不斷增加，并且從單藥抗藥性向多藥抗藥性發(fā)展。我國的海南、云南和廣西等省、自治區(qū)也有抗藥性瘧疾的流行。目前，瘧原蟲對幾乎每一種抗瘧藥都產(chǎn)生了抗性，瘧疾防治形勢非常嚴峻，迫切要求我們盡快搞清抗藥性產(chǎn)生的機制，以便采取措施防止或逆轉(zhuǎn)抗藥性的發(fā)生并指導(dǎo)新藥研究。近年來，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展及學(xué)科滲透大大推動了瘧原蟲抗藥性機制的遺傳學(xué)研究，本文就抗葉酸制劑及喹類藥物抗性的分子機制作一綜述。
　　1　抗葉酸制劑抗性的分子機制
　　1.1　二氫葉酸還原酶（DHFR）基因
　　乙胺嘧和環(huán)氯胍都是二氫葉酸還原酶抑制劑。研究表明，惡性瘧原蟲對兩藥產(chǎn)生抗藥性都與DHFR基因點突變相關(guān)，但二者存在差異［2,3］。迄今為止，共報道了6個DHFR基因編碼區(qū)變異：108位Ser→Asn或Thr,51位Asn→Ile,59位Cys→Arg,16位Ala→Val,164位Ile→Leu。單一點突變所致DHFR108位Ser變異成Asn即可產(chǎn)生乙胺嘧抗性，但對環(huán)氯胍的反應(yīng)性僅稍有降低。對乙胺嘧產(chǎn)生高度抗性則需其他位點突變共存，包括51位Asn→Ile和（或）59位Cys→Arg。而與環(huán)氯胍抗性相關(guān)的變異是DHFR108位Ser→Thr伴隨16位Ala→Val，同樣，該抗性株對乙胺嘧的敏感性變化不大。
　　另外，在對乙胺嘧和環(huán)氯胍交叉耐藥的惡性瘧原蟲中發(fā)現(xiàn)存在多個位點變異：DHFR164位Ile→Leu,108位Ser→Asn,59位Cys→Arg和（或）51位Asn→Ile。由于僅包含Asn-108和Arg-59變異的原蟲分離物不具有環(huán)氯胍抗性，因此，認為Leu-164變異在瘧原蟲對兩藥產(chǎn)生交叉抗性的機制中起重要作用［3］。
　　1.2　二氫蝶酸合成酶（DHPS）基因
　　磺胺類藥是二氫蝶酸合成酶抑制劑。研究發(fā)現(xiàn)，正是由于磺胺類藥作用的靶酶DHPS基因點突變，使得酶活性中心結(jié)構(gòu)域形狀改變，因而降低了對藥物的敏感性。體外低葉酸條件下實驗表明［4］，與磺胺多辛易感性降低相關(guān)的DHPS氨基酸變異主要包括581位Ala→Gly,436位Ser→Phe伴隨613位Ala→Thr/Ser,以及436位Ser→Ala,437位Ala→Gly。
　　磺胺多辛通常與乙胺嘧合用于治療惡性瘧疾。對兩藥聯(lián)用的體外研究揭示，瘧原蟲對乙胺嘧的易感性決定著兩藥協(xié)同作用的效果［5］。體內(nèi)研究也發(fā)現(xiàn)［6］，前面所述的DHFR變異類型均存在并與抗性程度相關(guān)，而DHPS基因突變與抗性的發(fā)生沒有明顯相關(guān)性，僅在抗性程度較高的玻利維亞地區(qū)可見Gly-581高度流行,Gly-437和Glu-540的發(fā)生與用乙胺嘧-磺胺多辛治療失敗率相當，這可能由于體外研究中葉酸和PABA水平不同于體內(nèi)。另一種解釋是Ala-436的變異可能僅在低度抗性時出現(xiàn)，且不與高度抗性時的變異Gly-437,Glu-540和Gly-581共存。因此推測，DHPS變異在臨床乙胺嘧-磺胺多辛抗性的產(chǎn)生中不起主導(dǎo)作用。
　　我們能夠肯定，體內(nèi)乙胺嘧-磺胺多辛抗性與DHFR基因突變相關(guān)，然而在抗性瘧流行區(qū)治療失敗率并不像突變發(fā)生率那樣高，提示體外研究發(fā)現(xiàn)的三種變異Asn-108，Ile-51和Arg-59不能完全解釋體內(nèi)高度抗性。在玻利維亞的高度抗性病例中曾發(fā)現(xiàn)Leu-164及另外兩個新的變異Arg-50和插入30-31位間的玻利維亞重復(fù)區(qū)高度流行，提示這些變異可能是在抗性發(fā)展的較高時期產(chǎn)生的，關(guān)系到治療的成敗。據(jù)此Plowe等［6］提出假設(shè)，體內(nèi)乙胺嘧-磺胺多辛抗性程度分級RⅠ,RⅡ,RⅢ正是基于DHFR和DHPS基因突變的不斷積累。由于現(xiàn)實中惡性瘧原蟲感染的復(fù)雜性及宿主免疫與葉酸水平的影響，事實上所檢測到的抗性突變往往是交叉重疊的。
　　總之，關(guān)于抗葉酸制劑的抗藥性分子機制已基本搞清。因此，我們可以根據(jù)特有的突變類型，運用分子生物學(xué)的方法，進行大規(guī)模的流行病學(xué)研究，這對于鑒定某一瘧疾流行區(qū)的藥物敏感性，從而指導(dǎo)臨床用藥具有重要意義；同時也可指導(dǎo)新藥設(shè)計及臨床藥物聯(lián)用，以最大限度地減少藥物抗性的發(fā)生。
　　2　喹類藥物抗性的分子機制
　　氯喹曾經(jīng)是使用最廣泛的抗瘧藥，由于抗性的發(fā)展及傳播，在大部分地區(qū)已不再具有以往的效力。影響抗性機理最終闡明的重要因素是喹類藥物作用機制還不十分清楚。不同地區(qū)的研究者報道關(guān)于氯喹抗性的一個共同特征是：抗氯喹蟲株較敏感性蟲株藥物聚集水平降低了。因此，氯喹的轉(zhuǎn)運和聚集不僅對其發(fā)揮抗瘧活性是必需的，而且與抗性表型密切相關(guān)，提示喹類藥物抗性產(chǎn)生可能與其作用方式?jīng)]有直接關(guān)系，這與抗葉酸制劑不同。
　　2.1　惡性瘧原蟲多藥耐藥基因（pfmdr1和pfmdr2）
　　研究發(fā)現(xiàn)，維拉帕米（一種鈣通道阻滯劑）可逆轉(zhuǎn)氯喹抗藥性，促使人們考慮氯喹抗性可能與哺乳動物腫瘤細胞多藥抗藥性（MDR）表型相似［7］。研究表明，腫瘤細胞產(chǎn)生MDR是由于一種ATP依賴性的、與藥物外排相關(guān)的蛋白過量表達所致，稱為P-糖蛋白，它定位于細胞表面，與許多不同類型的化合物有親合力［8］。在此基礎(chǔ)上，Krogstad等［9］發(fā)現(xiàn)抗氯喹株原蟲較敏感株排出氯喹的速率快40～50倍，且這種排出是能量依賴性的，并可被能量缺乏及ATP阻斷劑抑制。但是也有研究顯示,抗氯喹株與敏感株藥物外排率相等［10］；二者藥物聚集量的差別是由于最初的藥物攝入速率不同所致［11］。
　　哺乳動物MDR表型通常伴有mdr基因的擴增，導(dǎo)致其產(chǎn)物P-糖蛋白表達增加［8］。對惡性瘧原蟲基因的研究表明也存在mdr基因同系物，以pfmdr1和pfmdr2為主［12，13］。目前尚無證據(jù)表明pfmdr2及其表達產(chǎn)物與氯喹抗性有關(guān)，而有相當多的研究認為pfmdr1與抗藥性機制相關(guān)。
　　Pfmdr1編碼一個相對分子質(zhì)量約162的蛋白，稱為P-糖蛋白同系物1（Pgh1）。早期研究表明，在一些抗氯喹株中存在pfmdr1擴增［12，13］。免疫熒光及免疫電鏡技術(shù)觀察pfmdr1蛋白產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)Pgh1在紅內(nèi)期表達，主要定位于食物泡膜上，這與它可能充當氯喹轉(zhuǎn)運蛋白的角色一致，但是定量分析不能確認Pgh1過表達與抗藥性相關(guān)［14］。
　　Foote等［15］對pfmdr1基因3′多態(tài)性及等位基因變異分析表明，pfmdr1突變與氯喹抗性表型相關(guān)，并提出存在兩種類型抗性相關(guān)等位基因，一種可致單一氨基酸變異86位Asn→Tyr，為K1型；另一種則導(dǎo)致三種氨基酸變異，1034位Ser→Cys、1042位Asn→Asp和1246位Asp→Try,為7G8型。這可能分別代表著最早在東南亞和南美洲出現(xiàn)的氯喹抗性類型。以此為基礎(chǔ)，運用單盲法研究，曾正確地預(yù)測了36份樣品中的34份的藥物易感性。Adagu等［16］的研究也表明86位Tyr突變與氯喹抗性相關(guān)。但是，同時有些研究不能得到相同的結(jié)果。這提示可能pfmdr1不是唯一的控制抗性的基因。
　　氯喹抗性與pfmdr1的關(guān)系尚不明確，從選自氯喹抗性親代的甲氟喹抗性株中卻發(fā)現(xiàn)有pfmdr1的擴增，并且蟲株對甲氟喹抗性增加的同時對氯喹的易感性增加了［12］。Barnes等［17］的研究表明，隨著原蟲對氯喹抗性的增加，pfmdr1基因拷貝數(shù)減少，甲氟喹易感性增加，這無疑加強了pfmdr1擴增與甲氟喹抗性的關(guān)聯(lián)。因此推測pfmdr1擴增可能與氯喹高度抗性是不相容的，Pgh1的功能可能是促進對氯喹的易感性。
　　將pfmdr1基因轉(zhuǎn)染于異源表達系統(tǒng)中國倉鼠卵巢細胞（CHO），使其表達惡性瘧原蟲Pgh1，發(fā)現(xiàn)Pgh1表達伴隨有能量依賴性的藥物攝入增加［18］，而且Pgh1就定位于轉(zhuǎn)染的CHO細胞溶酶體上，經(jīng)測定，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染細胞溶酶體內(nèi)pH值有所下降，認為氯喹聚集增加可能是溶酶體酸化的結(jié)果，推測pfmdr1可能編碼一種液泡氯化物通道。當CHO細胞被攜帶有7G8型1034和1042位突變的pfmdr1基因轉(zhuǎn)染時，則發(fā)現(xiàn)氯喹易感性喪失，細胞聚集藥物及酸化溶酶體的能力減弱，這就從某種意義上證實了關(guān)于Pgh1促進氯喹易感性的推測。但這仍不足以解釋抗性。Ritchie等［19］發(fā)現(xiàn)源自氯喹抗性親代的鹵泛曲林抗株表現(xiàn)對鹵泛曲林、甲氟喹和奎寧敏感性降低而對氯喹敏感性增強，卻未檢測到任何pfmdr1基因序列或拷貝數(shù)及Pgh1表達的變化。
　　很明顯，關(guān)于pfmdr1與喹類藥物抗性的關(guān)系仍有很大疑問，可能抗性的發(fā)生有一定的地理學(xué)基礎(chǔ)，而尋找某個單一的基因來解釋抗性本身過于簡單化，氯喹抗性發(fā)生的緩慢及復(fù)雜性也不支持單基因決定抗性的假設(shè)。

下一頁

【瘧原蟲抗藥性的遺傳學(xué)研究進展】相關(guān)文章：

腦血管疾病和卒中的遺傳學(xué)進展03-08

紅花的現(xiàn)代研究進展03-18

降脂中藥研究進展03-19

干細胞的研究進展03-18

醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)設(shè)計性實驗課教學(xué)改革探討11-26

青霉素結(jié)合蛋白與細菌對-內(nèi)酰胺抗生素的抗藥性機理12-20

梯度功能材料的研究進展03-28

親和超濾技術(shù)的研究進展03-03

支原體感染研究進展03-08