雷帕霉素抑制大鼠移植肝膽管上皮細胞增殖作用的研究
作者：陳莉萍 戴睿武 郭毅斌 王曙光 董家鴻
【摘要】 目的 探討雷帕霉素對大鼠移植肝膽管上皮細胞增殖及其周圍成纖維細胞活化的抑制作用。方法 “2袖套法”建立大鼠原位肝移植模型，并隨機分為供肝冷保存1 h組、12 h組、雷帕霉素組(冷保存12 h組術后給予雷帕霉素)、對照組。分別于術后1、3、7、14 d檢測血清ALT、TB、ALP，免疫組化法檢測各組膽管上皮細胞增殖率及肌纖維母細胞分布，并統計各組生存率。結果 冷保存12 h組術后生存率明顯低于冷保存1 h組(P=0.017 4)，血清ALT>200 IU/L、ALP>160 IU/L、TB>3.6 μmol/L，持續高于冷保存1 h組(ALT<160 IU/L、ALP<200 IU/L、TB<3.6 μmol/L)，各時相點膽管上皮細胞增殖率(7%,27.8%,23.1%,17.8%)顯著高于冷保存1 h組(2%,6%,2.6%,2.3%)和對照組(1.3%)。冷保存12 h組術后7、14 d可見膽管周圍較多肌纖維母細胞聚集；雷帕霉素組術后2周生存率與冷保存12 h組接近(P=0.89)，膽管上皮細胞增殖率(5.9%,15.8%,13.6%,11.4%)明顯降低，膽管周圍肌纖維母細胞分布較少。結論 冷保存?再灌注直接損傷肝臟，誘導膽管上皮細胞增殖及肌纖維母細胞聚集，雷帕霉素明顯抑制膽管上皮細胞增殖及肌纖維母細胞活化并對移植肝具有保護作用。
【關鍵詞】 雷帕霉素； 肝移植； 冷保存； 再灌注； 膽管上皮細胞； 增殖
【Abstract】 Objective To investigate the inhibitive effect of rapamycin on proliferation of biliary epithelial cells and activation of peribiliary fibroblast after rat liver transplantation. Methods After rat liver transplantation model was made based on “two cuff” method, SD rats were randomly divided into cold preservation (CP) for 1 hour group (CP 1 hour group), CP 12 hours group, rapamycin group (CP 12 hours group treated with rapamycin) and control group. Alanine aminotransferase (ALT), total bilirubin (TB) and alkaline phosphatase (ALP) were determined at days 1, and 14 after liver transplantation. Immunohistochemical method was used to detect proliferation rate of biliary epithelial cells and distribution of myofibroblasts, and survival rate of each group was also analyzed. Results The survival rate in CP 12 hours group was significantly lower than that in CP 1 hour group (P=0.0174). In CP 12 hours group, serum ALT was >200 IU/L, ALP >160 IU/L and TB>3.6 μmol/L, which were significantly higher than those in CP 1 hour group respectively (ALT<160 IU/L, ALP<200 IU/L, TB<3.6 μmol/L). At different time points, proliferation rates of biliary epithelial cells were 7%, 27.8%, 23.1% and 17.8% in CP 12 hours group, but were 2%, 6%, 2.6% and 2.3% in CP 1 hour group and 1.3% in control group, with statistical difference. Myofibroblasts were determined markedly surrounding the bile ducts at days 7 and 14 while survival rate significantly decreased in CP 12 hours group. In rapamycin group, proliferation rate of biliary epithelial cells was significantly decreased to 5.9%, 15.8%, 13.6% and 11.4%, with marked decrease of myofibroblasts accumulation surrounding the bile duct in comparison with CP 12 hours group, while survival rate showed no statistical difference compared with CP 12 hours group (P=0.89). Conclusions CP and reperfusion directly bring about damage to the liver and subsequently induce proliferation of biliary epithelial cells and accumulation of peribiliary fibroblast. The proliferation of biliary epithelial cells and activation of peribiliary fibroblast can be inhibited by rapamycin that may exert protective effect on the liver.
【Key words】 Rapamycin; Liver transplantation; Cold preservation; Reperfusion; Biliary epithelial cells; Proliferation
肝移植術后常見的膽道并發癥為非吻合口狹窄，占所有膽道并發癥的20%［1］，而冷保存?再灌注對膽管樹的直接損傷是此類并發癥重要的因素。作為肝移植過程中不可避免的病理生理過程，冷保存?再灌注直接損傷膽管上皮細胞，誘導正常情況下處于細胞周期靜止狀態的膽管上皮細胞發生增殖。這種對損傷做出的修復過程極有可能并發其他膽道疾病［2］。因此研究影響膽管上皮細胞增殖的因素對于臨床防治膽道疾病具有重要意義。本研究是在大鼠原位肝移植模型基礎上，探討雷帕霉素對肝移植術后膽管上皮細胞增殖及其周圍肌纖維母細胞聚集的影響，旨在為臨床防治移植肝膽道并發癥提供新的策略。
1 材料與方法
1.1 主要試劑與儀器
兔抗增殖細胞核抗原多克隆抗體、鼠抗p?STAT3?tyr705單克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司；ChemMateTM Envision免疫組化試劑盒為丹麥Dako公司產品；RPM為美國惠氏百宮制藥公司惠贈。
1.2 動物模型與分組
清潔級SD大鼠，體重220～250 g，雄性，由第3軍醫大學大坪醫院動物中心提供。按隨機數字表法分為4組：(1)對照組；(2)冷保存1 h組：供肝冷保存1 h后行原位肝移植；(3)冷保存12 h組：供肝冷保存12 h后行原位肝移植；(4)雷帕霉素組：冷保存12 h組給予靜注雷帕霉素2 mg/(kg·d)。大鼠原位肝移植模型制作參照劉驊等［3］的“2袖套法”原位肝移植模型并加以改良，顯微外科縫合肝上下腔靜脈、套接門靜脈及肝下下腔靜脈。利用小兒靜脈留置針內蕊作為動脈支架管，直接對合供受體肝固有動脈，完成肝動脈重建。無肝期約13 min。分別于術后1、3、7、14 d取材，每組樣本各8只。
1.3 各組術后生存分析
觀察冷保存1 h組、 12 h組、 雷帕霉素組術后14 d存活情況，繪制生存曲線并比較各組生存率的差異。
1.4 肝功能指標檢測
測定冷保存1 h組、12 h組、雷帕霉素組ALT、ALP、TB。
1.5 兔抗增殖細胞核抗原、α?平滑肌肌動蛋白免疫組織化學檢測
肝組織常規固定、包埋、切片。采用兔抗增殖細胞核抗原作為細胞增殖期G1?S期的評價指標，α?平滑肌肌動蛋白作為肌纖維母細胞標志。按Chem?MateTM Envision免疫組化試劑盒說明書操作。顯微鏡下觀察α?平滑肌肌動蛋白表達陽性細胞的胞質呈棕色，增殖細胞的胞核呈棕色。計算7個高倍鏡(×400)視野內，每100個膽管細胞中增殖的膽管上皮細胞所占比例的均值作為該樣本的膽管上皮細胞增殖率［4］。
1.6 統計學分析
計量資料以±s表示，所有數據應用SPSS 10.0軟件進行統計分析，多組均數間的比較采用單因素方差分析，采用Kaplan?Meier法繪制生存曲線，Log?rank法檢驗各組生存率之間的差異。
2 結果
2.1 各組術后生存分析
冷保存12 h組生存率明顯低于冷保存1 h組(P=0.017 4)，而與雷帕霉素組水平接近(P=0.89，圖1)。兩組大鼠死亡的主要原因為移植肝肝功能不全，表現為肝臟淤血或伴有局灶性壞死，腹水、黃疸，肝功能酶譜升高，部分死亡大鼠膽管內可見褐色膽泥形成。
圖1 各組肝移植術后生存曲線
2.2 各組肝功能檢測
冷保存1 h組術后7 d內，肝功能各項指標趨于正常。冷保存12 h組血清ALT、ALP水平明顯高于冷保存1 h組同時相點水平，術后14 d達到峰值；血清TB水平呈上升趨勢，術后3 d顯著高于冷保存1 h組；雷帕霉素組各項指標均明顯低于冷保存12 h組同時相點水平(表1～3)。表1 血清ALT水平的檢測表2 血清ALP水平的檢測表3 血清TB水平的檢測
2.3 各組膽管上皮細胞增殖
對照組、冷保存1 h組膽管上皮細胞增殖較少，冷保存12 h組膽管上皮細胞增殖率明顯高于其他各組同時相點水平，術后3 d達到峰值，其中大膽管內壁膽管上皮細胞增殖較為明顯；雷帕霉素組膽管上皮細胞增殖率明顯低于冷保存12 h組(表4，圖2)。表4 膽管上皮細胞增殖率的檢測
2.4 膽管周圍肌纖維母細胞分布
對照組、冷保存1 h組、12 h組術后1 d，肌纖維母細胞主要見于血管壁。冷保存12 h組術后3 d，膽管周圍環繞少量肌纖維母細胞，至7、14 d明顯增加；雷帕霉素組術后各時相點，膽管周圍肌纖維母細胞分布明顯少于冷保存12 h組(圖3)。
A：冷保存1 h組術后3 d，偶見增殖膽管上皮細胞；B：冷保存12 h組術后3 d，較多膽管上皮細胞增殖；C：冷保存12 h組術后14 d仍可見膽管上皮細胞增殖；D：雷帕霉素組術后3 d，膽管上皮細胞增殖較少
圖2 肝移植術后膽管上皮細胞增殖(紅色箭頭所示為增殖細胞) (2氨基聯苯胺染色 ×400)
A：對照組肌纖維母細胞主要分布于血管壁；B：冷保存12 h組術后3 d，膽管周圍少量肌纖維母細胞環繞；C：冷保存12 h組術后14 d，較多肌纖維母細胞環繞于膽管周圍；D：雷帕霉素組術后14 d，膽管周圍肌纖維母細胞較少出現
圖3 肝移植術后肌纖維母細胞分布(紅色箭頭所示為肌纖維母細胞) (2氨基聯苯胺染色 ×400)
3 討論
作為與肝移植術后膽道并發癥密切相關的病理生理過程，冷保存?再灌注直接損傷肝細胞和膽管上皮細胞。膽管上皮細胞是1族高氧耗、高代謝、低缺氧耐受的嬌貴細胞群體，較肝細胞更易在缺血?再灌注時受到氧自由基的損傷［5］。我們的研究發現，冷保存12 h組術后各時相點，反應膽道損傷的酶譜ALP、TB明顯升高，表明嚴重的冷保存?再灌注明顯損傷膽管上皮細胞。出于對損傷修復的需要，以細胞增殖為特征的再生?修復過程被啟動，在本研究中則表現為該組膽管上皮細胞的明顯增殖。
殘存的膽管上皮細胞在對損傷做出再生修復時，雖然最終能恢復到近似原先的細胞形態，但在該過程中極有可能經歷DNA損傷或基因序列改變，具有和正常細胞不同的功能，分泌多種與器官纖維化密切相關的細胞因子如TGF?β等，促進膽管周圍成纖維細胞活化轉化為肌纖維母細胞，而后者的持續出現是器官纖維化過程的關鍵［6］。同時，大量而活躍的細胞分裂需要消耗較多的能量，就有可能削弱肝內非新生細胞正常的能量代謝過程［7］。這對移植物的長期存活及功能是不利的。我們觀察到伴隨著明顯的膽管上皮細胞增殖，較多肌纖維母細胞環繞于冷保存12 h組膽管周圍。這表明嚴重冷保存?再灌注誘導的膽管上皮細胞增殖可能是促進肌纖維母細胞聚集的重要因素。由于膽管上皮細胞和膽管周圍肌纖維母細胞之間維持著非常精妙的平衡，冷保存?再灌注對膽管上皮細胞的嚴重損傷觸發肌纖維母細胞的大量活化，導致膽管壁創面收縮，增加了膽管壁及其周圍組織纖維化和膽管狹窄形成的風險，在肝外膽管或肝內大膽管常表現為管腔狹窄，在小膽管則可能出現管腔阻塞［8］。我們還觀察到大膽管尤其肝門附近大膽管內壁的膽管上皮細胞增殖最為活躍，該區結締組織豐富，內含大量成纖維細胞，極易受到膽管上皮細胞增殖的影響而活化為肌纖維母細胞。這也許正是臨床觀察到的肝門附近大膽管成為移植肝膽道狹窄易患部位的原因之1，也是影響移植物功能與存活的重要因素。
作為1種新型免疫抑制劑，體外和體內實驗均證實雷帕霉素抑制膽管上皮細胞增殖，其有效抑制濃度遠低于臨床肝移植術后患者應用雷帕霉素作為免疫抑制劑時的血藥濃度［9］。我們的研究也發現，雷帕霉素明顯抑制由冷保存?再灌注損傷誘導的膽管上皮細胞增殖，并減少膽管周圍肌纖維母細胞的聚集。雷帕霉素是信號轉導及轉錄激活因子?3活化的特異性抑制劑，因而部分阻斷轉錄激活因子?3介導的信號通路，從而調控細胞周期進展，影響細胞增殖與分化［10］，這可能是其抑制膽管上皮細胞增殖的分子機制之1。同時我們還觀察到，雷帕霉素雖然明顯抑制肝移植術后膽管上皮細胞的增殖，但并未降低術后14 d內生存率，進1步提示以膽管上皮細胞增殖為靶點的雷帕霉素極可能成為臨床防治移植肝膽管周圍纖維化、膽管狹窄等并發癥的有力武器，將會更廣泛地應用于肝移植領域。
【參考文獻】
［1］ Guichelaar MM, Benson JT, Malinchoc M, et al. Risk factors for and clinical course of non?anastomotic biliary strictures after liver transplantation. Am J Transplant,2003,3(7):885-890.
［2］ Ramadori G, Saile B. Portal tract fibrogenesis in the liver. Lab Invest,2004,84(2):153-159.
［3］ 劉驊，曹暉，吳志勇.改良2袖套法大鼠原位肝移植180例.消化外科,2006,5(1):52-56.
［4］ Alvaro D, Alpini G, Onori P,
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