研究青天葵活性部位的體外抗腫瘤作用
摘要：目的確定廣西特產藥材青天葵體外抗腫瘤作用的活性部位。方法青天葵部位提取物的制備主要采用溶劑法, 青天葵全草先用95%的乙醇提取，得到的提取物進一步用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、甲醇依次提取，得到極性由小到大的4個提取部位。活性篩選采用MTT法實驗，觀察青天葵提取物對7種腫瘤細胞的生長抑制作用。結果青天葵石油醚和醋酸乙酯部位具有一定的體外抗腫瘤作用。結論首次確定了青天葵的石油醚和醋酸乙酯部分是體外抗腫瘤作用的有效部位。關鍵詞： 青天葵 體外抗腫瘤作用 活性部位
青天葵為蘭科Orchidaceae植物毛唇芋蘭Nervilia
foadii(Hance) Schltr.的干燥全草，入藥始載于《嶺南采藥錄》，主要產于我國的廣西、廣東、海南，四川、云南，泰國也有分布，是廣西特產藥材［1～3］，具有清肺止咳、健脾消積、鎮痛止痛、散淤消腫、清熱解毒之功效，主治肺癆、咳嗽咳血、中毒、跌打損傷、小兒積、精神病、口腔炎、急性咽喉炎等癥。近來還用含有青天葵的復方制劑治療鼻咽癌以緩解癥狀［4］，但未發現國內外對其抗腫瘤有效成分及藥理作用的研究。為此，筆者對青天葵的干燥全草進行了藥效學實驗研究，對青天葵的石油醚、氯仿、醋酸乙酯、甲醇4個不同部位采用體外抗腫瘤實驗進行初篩，為闡明青天葵的抗腫瘤作用并篩選出有效部位打下基礎。現報道如下。
1 材料與儀器
1.1 受試樣品
藥材青天葵來源于南寧藥材站，經廣西中醫學院劉壽養副教授鑒定為蘭科Orchidaceae植物毛唇芋蘭Nervilia foadii(Hance) Schltr.的干燥全草。對青天葵的干燥全草進行提取分離得4個部位：石油醚提取物（A）、醋酸乙酯提取物（B）、正丁醇提取物（C）、乙醇提取物（D）。A，B，C和D均用含有DMSO的培養液溶解，均配成濃度為480 μg/ml的溶液，置于-20℃冰箱密閉避光保存。臨用前用不含血清和抗生素的RPMI1640（NG108-15用DMEM）液稀釋至所需濃度，DMSO終濃度在0.01%水平。
1.2 培養液
1.2.1 RPMI完全培養液含RPMI1640培養基（GIBCO）、3%谷氨酰胺、卡那霉素750 μg/ml、10% FBS（臨用前加）。
1.2.2 DMEM完全培養液含DMEM培養基（GIBCO）、卡那霉素750μg/ml、10鸖（臨用前加）。
1.3 細胞株 白血病細胞株L1210和P388D1、宮頸癌細胞株Hela、人胃癌細胞株SGC7901、黑色素瘤細胞株B16、神經腫瘤細胞株NG108-15等均購自上海細胞生物研究所細胞庫，人肝癌細胞株Hela7404由廣西醫科大學藥理教研室提供。
1.4 試劑
MTT（四甲基噻唑藍）為德國Sigma公司產品，批號020609；FBS（胚胎牛血清）為美國Hyclone公司產品，批號0405；RPMI1640和DMEM培養基為GIBCO公司產品，批號1120708和0311；Trypsin（胰蛋白酶）由天津市灝洋生物制品有限責任公司提供，批號200503；DMSO（二甲基亞砜）由天津匯英化學試劑有限公司提供，批號20040526。
1.5 細胞培養腫瘤細胞用含10%滅活新生小牛血清的RPMI1640（NG108-15腫瘤細胞用DMEM）培養基在37℃，15%CO2條件下培養，取對數生長期細胞用于實驗。
1. 6 儀器
Thermo Forma型CO2培養箱，美國產；Olympus型倒置顯微鏡，日本產；Biocell型酶標儀，奧地利產；AG135型電子天平，瑞士產；培養瓶，美國產；3072型96孔板，丹麥產；3001型培養皿，美國產；DLF560型超凈工作臺，荷蘭產；HV-50自動高壓滅菌器，日本產。
2 方法
2.1 樣品的提取分離
將青天葵藥材陰干，去除雜質，粉碎為粗粉，稱取9.0 kg藥材粗粉，用95%乙醇（食用）浸泡48 h后滲濾提取，用10倍量乙醇提取。合并乙醇提取液，減壓回收乙醇，得粗提物，干燥后得921.3 g（得膏率10.2%）。將所得的粗提物用硅膠拌勻后，依次用石油醚（60～90℃）、醋酸乙酯、正丁醇、甲醇回流提取，回收溶劑，得石油醚部位180 g，醋酸乙酯部位87.5 g，正丁醇部位86 g，甲醇部位50 g。
2.2 MTT法
取對數生長期細胞以0.25%胰蛋白酶和0.02鞹A消化后，用培養液稀釋。在96孔培養板中每孔加入200 μl（含有5 000個/ml腫瘤細胞）含10鸖的RPMI1640培養液，NG108-15細胞則用含10鸖的DMEM培養液，細胞置37℃，10%CO2培養24 h后，實驗組分別加入最終濃度為15，30，60，120，240 μg/ml提取物的培養液，對照組則加入等體積溶劑的培養液，每組4孔，重復4次。置37℃，10%CO2培養5 d后，棄去上清液，加入200 μl/孔新鮮配置的含0.2 mg/ml MTT的無血清培養液，37℃繼續培養4 h，棄上清液，加入200 μl DMSO，振蕩混勻后，在酶標儀上以波長為550 nm，參比波長為450 nm測定OD值。
2.3 藥物對腫瘤細胞生長的抑制率的計算方法［5］
腫瘤細胞生長抑制率（%）=［（1-實驗組平均OD值）/對照組平均OD值］×100%
2.4 半數抑制濃度ⅠC50的計算
2.4.1 直線回歸法［6］
當細胞生長抑制率與藥物濃度有對數關系時，以各個不同藥物的對數濃度為橫坐標，相應的細胞生長抑制率為縱坐標，求出直線回歸方程，根據該方程計算出IC50。
2.4.2 改良寇氏法［7］
當細胞生長抑制率與藥物濃度不存在對數關系時，采用寇氏法計算IC50。藥物IC50值的公式為：IC50=lg-1［Xm-i (∑p-0.5)］。式中Xm：設計的最大濃度的對數值；i：相鄰兩組濃度對數值之差；∑p：各組生長抑制率之和；0.5：經驗常數。
3 結果
3.1 不同濃度提取物對白血病細胞株L1210的抑制結果見表1。石油醚部位和醋酸乙酯部位對白血病細胞株L1210都有直接抑制作用，抑制率與提取物濃度成正比。細胞生長抑制率與藥液濃度無對數關系，故采用寇氏法計算IC50，IC50分別為83.5 μg/ml和76.2 μg/ml。正丁醇部位和甲醇部位對白血病細胞株L1210基本無活性。表1 受試樣品對白血病細胞株L1210抑制的影響(略)
3.2 不同濃度提取物對白血病細胞株P388D1的抑制結果見表2。石油醚部位和
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