阿斯匹林類(lèi)藥物和α┐晶體蛋白保護(hù)酯酶的失活
以下是YJBYS求職網(wǎng)與您分享的一篇關(guān)于阿斯匹林類(lèi)藥物和α┐晶體蛋白保護(hù)酯酶的失活的藥學(xué)畢業(yè)論文，歡迎瀏覽！
摘 要:目的 研究阿斯匹林類(lèi)藥物和α-晶體蛋白對(duì)酯酶的保護(hù)作用. 方法 凝膠色譜分離牛α-晶體蛋白，酯酶分別與糖類(lèi)、磷酸糖、氰酸鉀和激素加阿斯匹林（Asp）、布洛芬（Ibu）、撲熱息痛（Para）和α-晶體蛋白溫育，采用分光光度法測(cè)定酶活性. 結(jié)果 糖化、氨甲酰化和類(lèi)固醇誘導(dǎo)酯酶失活的作用呈濃度依賴(lài)性，類(lèi)固醇失活效應(yīng)最快.10mmol L-1 Asp可部分保護(hù)果糖和類(lèi)固醇誘導(dǎo)酯酶的失活，盡管Ibu抑制酶活性，但其羧基化（Ibu-1）和羥基化（Ibu-2）代謝物有保護(hù)作用.α-晶體蛋白與酯酶摩爾比為1 1時(shí)，可完全特異地保護(hù)果糖、果糖6-磷酸和潑尼松龍-21-半琥珀酸誘導(dǎo)的酯酶失活;而在1 4時(shí)，保護(hù)率分別為67.0%，55.0%和38.3%. 結(jié)論 Asp和Ibu保護(hù)酯酶免于失活的作用機(jī)制可能不同;α-晶體蛋白作為分子伴侶可保護(hù)酯酶免于失活.
Keywords:α-crystallin;aspirin;ibuprofen;esterase;glyca-tion;carbamylation;steroid
Abstract:AIM To investigate the protection effect of as-pirin-like drugs andα-crystallin on inactivation of esterase by glycation.METHODS Bovineα-crystallin was isolated by gel chromatography.Esterase were incubated with sugars，sugar phosphate，potassium cyanate and steroid or with as-pirin，ibuprofen，paracetamol andα-crystallin respectively.The enzyme activities were assayed by the spectropho┐tometer.RESULTS Inactivation of esterase was induced by glycation，carbamylation and steroid in a concentration-dependant manner.Steroid displayed a more rapid inactiva-tion effect than others.10mmol L-1 Aspirin partially pro-tected esterase against inactivation by fructose and steroid.Although Ibuprofen inhibited esterase，its carboxylated（I）and hydroxylated（II）metabolites showed a limited protec-tion.α-Crystallin fully protected esterase against inactivation by fructose，fructose6-phosphate and prednisolone-21-hemisucciate at a molar ratio of1 1，but only to the extent of67.0%，55.0%and38.3%of activity at a molar ratio of1 4respectively.CONCLUSION Aspirin and ibuprofen may play a different role in protection enzymes against inactiva-tion.α-Crystallin acts as a molecular chaperone to protect es-terase against inactivation.
0 引言
臨床流行病和實(shí)驗(yàn)研究表明阿斯匹林類(lèi)藥物作為非甾體類(lèi)抗炎藥，可預(yù)防和治療白內(nèi)障等一類(lèi)結(jié)構(gòu)性疾病（conformational disease）.α-晶體蛋白分子伴侶（molecular chaperone）功能的發(fā)現(xiàn)，為白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制的研究提供了新的理論依據(jù).糖化、氨甲酰化和長(zhǎng)期大量應(yīng)用激素等是白內(nèi)障發(fā)病的主要危險(xiǎn)因素［1-3］ .酯酶具有重要的生理功能，糖尿病患者、實(shí)驗(yàn)性大鼠血漿及老年性白內(nèi)障晶狀體中酯酶活性下降，可能在糖尿病并發(fā)癥和老化病程中起重要作用［4-7］ .我們通過(guò)觀察阿斯匹林類(lèi)藥物和α-晶體蛋白對(duì)酯酶的保護(hù)作用，探討白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制和潛在的治療途徑.
1 材料和方法
1.1 材料 酯酶（豬肝臟羧酸酯酶EC3.1.1.1）、核糖、果糖、6-磷酸葡糖（G6P）、果糖6-磷酸、葡萄糖、氰酸鉀、潑尼松龍-21-半琥珀酸（P-21-H）、阿斯匹林（Asp）、布洛芬（Ibu）和撲熱息痛（Para）、牛血清白蛋白和雞蛋溶菌酶等均為Sigma公司產(chǎn)品.Ibu的兩種主要代謝物2-［4（2-羧丙烷基）苯基］丙酸菌素酸（Ibu-1）和2-［4（2-甲基-2-羥丙烷基）苯基］丙酸菌素酸（Ibu-2）由Shyadehi等［8］ 提供.凝膠柱Sephacryl S-300HR為Phamacia公司產(chǎn)品.
1.2 方法
1.2.1 α-晶體蛋白分離和純化［9］ 8只1.5歲新鮮牛透明晶狀體去囊膜，分離皮質(zhì)和核，勻漿（0.05mol L-1 磷酸鈉緩沖液、0.2mol L-1 KCl，1mmol L-1 EDTA，1mmol L-1 EGTA;pH6.7），混合物以22440g離心40min.采用凝膠柱Sephacryl S-300HR分離晶狀體結(jié)構(gòu)蛋白（凝膠柱100cm×2.3cm，流速25mL h-1 ），根據(jù)色譜圖分別收集αH ，αL ，βH ，βL 和γ-晶體蛋白，透析24h，低溫冷凍干燥，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?SDS-PAGE檢測(cè)α-晶體蛋白的純度.
1.2.2 酶溫育和活性測(cè)定［7］ 酯酶（5IU，30.3μg）溶解于50mmol L-1 磷酸鈉緩沖液（pH6.8），首先與果糖（0.45，0.9，5，10和20mmol L-1 ）溫育，其中20mmol L-1 為糖基化適宜濃度，并分別與20mmol L
-1 的核糖、G6P、葡萄糖、果糖6-磷酸（5，10和20mmol L-1 ）;氰酸鉀（10，20，50和100mmol L-1 ），P-21-H（1，2，5和10mmol L-1 ）混合并通過(guò)0.2μm微孔過(guò)濾器，分裝于消毒小玻璃瓶，37℃水孵箱振動(dòng)溫育1～13d.酶活性測(cè)定以酯酶催化p-硝基苯醋酸（PNPA）的水解率來(lái)表示.首先將PNPA溶解于乙腈中配成60mmol L-1 的儲(chǔ)備液，以防止水解.1mL的PNPA與50mmol L-1 磷酸鈉緩沖液（pH6.8）19mL混合，取1mL稀釋液與0.2mL酶溶液混合于1.4mL的比色杯中，28℃下，通過(guò)檢測(cè)100s內(nèi)400nm光吸收酶水解降率來(lái)測(cè)定酯酶的活性［7］ .
1.2.3 阿斯匹林類(lèi)藥物與酯酶的溫育 10mmol L-1 的Asp，Ibu和Para與酯酶混合，分別加或不加20mmol L
-1 果糖、1mmol L-1 P-21-H和50mmol L-1 氰酸鉀水振動(dòng)孵育7d;酯酶與10mmol L-1 Ibu，5或10mmol L-1 Ibu-1和Ibu-2混合溫育.第6日，在微過(guò)濾前用50mmol L -1 磷酸鈉緩沖液（pH6.8）沖洗1～4次，離心（6000g，5min），并分別檢測(cè)酶活性.
1.2.4 α-晶體蛋白與酯酶的溫育 α-晶體蛋白（3.4，6.7和13.4mg L-1 ）和對(duì)照蛋白分別與酯酶混合后，加或不加20mmol L-1 果糖、10mmol L-1 果糖6-磷酸、50mmol L-1 氰酸鉀、1mmol L-1 P-21-H，10mmol L-1 Ibu和Para水振動(dòng)溫育7d，分別檢測(cè)酶活性，并與正常對(duì)照比較，以百分比表示α-晶體蛋白的分子伴侶活性.
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:結(jié)果均采用Student t檢驗(yàn).
2 結(jié)果
2.1 酯酶的穩(wěn)定性 酯酶（30.3μg）溶解于50mmol L-1 磷酸鈉緩沖液（pH6.8），室溫下放置1d，酶活性穩(wěn)定;37℃水孵箱振動(dòng)溫育6和10d，酶活性分別下降（8.2±3.6）%和（9.4±2.8）%.
2.2 糖化誘導(dǎo)的酯酶失活 溫育5d，果糖（0.45，0.9和5.0mmol L-1 ）并未明顯導(dǎo)致酶失活.20mmol L-1 果糖和核糖具有快速糖基化作用，溫育2d，殘留酶活性分別為（70.7±4.7）%（P=0.0019）和（60.8±5.7）%（P=0.0099）.G6P和葡萄糖為緩慢抑制作用，溫育7d，酶活性分別為（65.7±3.5）%（P=0.0043）和（87.6±5.2）%（P=0.0564）;溫育13d，葡萄糖組才有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0039）（Fig1）.果糖6-磷酸表現(xiàn)為時(shí)間濃度依賴(lài)性酶失活效應(yīng)，溫育3d，10mmol L-1 果糖6-磷酸已使酶失活差異具有顯著性.
圖1 糖化誘導(dǎo)酯酶的失活 略
2.3 氨甲酰化和激素誘導(dǎo)酯酶失活 P-21-H（5和10mmol L-1 ）迅速失活酶，甚至1和2mmol L-1 在溫育2d時(shí)，已顯著失活酶，殘留酶活性分別為（75.6±7.2）%（P=0.0278）和（74.2±3.9）%（P=0.0074）（Fig2）.盡管使用較高濃度（20，50和100mmol L-1 ），氰酸鉀對(duì)酶失活作用仍較弱.50mmol L-1 氰酸鉀溫育2和4d，殘留酶活性分別為（59.4±9.8）%（P=0.0470）和（39.5±4.6）%（P=0.0002）.
2.4 Ibu和Para抑制酯酶活性 溫育前10mmol L-1 的Ibu已表現(xiàn)抑制酶活性，與對(duì)照比較殘留活性為（46.3±3.2）%（P=0.0012），這種抑制作用進(jìn)展緩慢;溫育5d，酶活性為（31.7±0.4）%（P=0.0001）.溫育6d，過(guò)濾后仍保留40.0%的酶活性，沖洗1或4次之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.Para表現(xiàn)為時(shí)間依賴(lài)性抑制效應(yīng)，溫育前和溫育1，2和3d，10mmol L-1 的Para使酶活性?xún)H剩余（85.7±8.5）%（P=0.0991），（52.4±3.1）%（P=0.0042），（16.7±5.9）%（P=0.0017）和（10.8±2.2）%（P=0.0002）.而10mmol L-1 的Asp溫育5d，并未造成顯著的酶活性喪失.
2.5 Asp，Ibu┐1和Ibu┐2對(duì)酯酶的保護(hù)作用 Asp，羧化的Ibu-1和羥化的Ibu-2可保護(hù)果糖和P-21-H誘導(dǎo)酯酶的失活（Tab1）.溫育3d后，10mmol L-1 的Asp保護(hù)P-21-H誘導(dǎo)酯酶的失活有顯著性差異（P=0.0024）;10mmol L-1 的Ibu-1和Ibu-2分別保護(hù)果糖和P-21-H誘導(dǎo)酯酶的失活具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.
圖2 氨甲酰化和皮質(zhì)激素誘導(dǎo)酯酶失活 略
表1 Asp和Ibu-1/Ibu-2對(duì)果糖和P-21-H誘導(dǎo)酯酶失活的保護(hù)作用 略
圖3 α-晶體蛋白保護(hù)果糖6-磷酸誘導(dǎo)酯酶的失活 略
2.6 α-晶體蛋白保護(hù)酯酶的失活 與對(duì)照蛋白比較，α-晶體蛋白與酯酶分子摩爾比為1 1時(shí)，可特異地完全保護(hù)果糖、果糖6-磷酸和P-21-H誘導(dǎo)酯酶的失活，而在1 4時(shí)，保護(hù)率分別為67.0%，55.0%和38.3%.溫育4d時(shí)，α-晶體蛋白（1 4）可保護(hù)果糖6-磷酸誘導(dǎo)的酯酶失活（Fig3）.在溫育3和5d時(shí)，P-21-H組酶活性分別為（70.4±2.9）%和（44.5±4.9）%;加α-晶體蛋白（1 4）后，分別為（83.8±7.1）%（P=0.0301）和（75.2±5.3）%（P=0.0038）.α-晶體蛋白無(wú)保護(hù)氰酸鉀誘導(dǎo)酯酶失活的作用.α-晶體蛋白（1 2）部分保護(hù)Para抑制酯酶的失活，但對(duì)Ibu抑制作用無(wú)效，盡管溫育5和9d，牛血清白蛋白分別部分保護(hù)果糖和果糖6-磷酸誘導(dǎo)酯酶失活，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.
3 討論
1974年首次報(bào)道酯酶存在于晶狀體，并已在人血清中分離出4種類(lèi)型酯酶，但由于其生理功能復(fù)雜，因而作用機(jī)制尚不確切.Kamei（1996）從正常人晶狀體可溶性蛋白質(zhì)中分離純化出兩種酯酶，它們有不同的最適pH值、溫度和Km值.其中酯酶Ⅰ的Mr 為200000，酯酶Ⅱ的Mr 為30000.隨著老化酶活性顯著下降;老年性白內(nèi)障晶狀體酯酶活性與正常同齡人比較也明顯降低，提示晶狀體中酯酶活性下降與白內(nèi)障形成有密切關(guān)系［6］ .糖尿病患者外周血淋巴細(xì)胞和血漿酯酶活性的下降與感染機(jī)率的增加有關(guān)［4］ .糖化、氨甲酰化和激素作為白內(nèi)障致病因素可誘導(dǎo)酯酶失活，可能是通過(guò)與賴(lài)氨酸基團(tuán)N-端游離α-氨基或ε-氨基反應(yīng)，以降低其電荷.若該反應(yīng)位于或靠近酶活性位點(diǎn)，可直接失活酶或通過(guò)結(jié)構(gòu)性改變間接失活酶［1，10］ .晶狀體蛋白周?chē)嬖谠S多活性小分子，包括糖、來(lái)源于尿中的氰酸鹽、糖皮質(zhì)激素和具有活性的代謝產(chǎn)物等，這些均可在非酶環(huán)境下攻擊蛋白質(zhì).
糖化是糖的碳基團(tuán)與蛋白質(zhì)氨基（通常是賴(lài)氨酸或N-端氨基）反應(yīng)，形成Schiff堿基，進(jìn)而蛋白質(zhì)交聯(lián)，通過(guò)復(fù)雜的通路轉(zhuǎn)變成不可逆轉(zhuǎn)的高級(jí)糖化最終產(chǎn)物.本實(shí)驗(yàn)中糖化失活酯酶的程度與其他酶學(xué)研究類(lèi)似［10］ ，即糖化強(qiáng)度依次為核糖>果糖>G6P>葡萄糖.英國(guó)牛津和印度的流行病調(diào)查研究表明，嚴(yán)重的腹瀉是白內(nèi)障發(fā)病的高危因素［2］ .腹瀉造成血中異氰酸鹽的增高可能是主要原因.異氰酸是氨甲酰化的活性物質(zhì)，生理性pH條件下，氰酸鹽可逆地與蛋白質(zhì)巰基或不可逆地與氨基（主要是賴(lài)氨酸的ε氨基）共價(jià)結(jié)合.隨著人的老齡化，血中的異氰酸含量逐漸增加.P-21-H的失活作用較糖和氰酸鉀顯著，可能由于潑尼松龍的側(cè)鏈有活化的碳酰基和醌-A環(huán)，可與蛋白質(zhì)氨基C-20的活性碳基團(tuán)反應(yīng)形成Schiff堿基（類(lèi)似糖化），并重組為更穩(wěn)定的加合物有關(guān)［10］ .本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，阿斯匹林可能通過(guò)氨乙酰化作用部分保護(hù)果糖和類(lèi)固醇誘導(dǎo)酯酶的失活.而Ibu抑制酶活性，但其羧基化（Ibu-1）和羥基化（Ibu-2）代謝物有保護(hù)作用，Ibu-2的作用略強(qiáng)于Ibu-1，但差異無(wú)顯著性，可能是代謝產(chǎn)物增加了其親水性的原因.Ibu是2-手性芳基丙酸的衍生物，主要的代謝物是Ibu-1，有2個(gè)非對(duì)稱(chēng)中心和1個(gè)立體同質(zhì)異構(gòu)體;而Ibu-2有1個(gè)非對(duì)稱(chēng)中心和1對(duì)鏡像體.尿中含微量1-和2-羥基化Ibu.po Ibu后約80.0%的兩種代謝物以成對(duì)或非成對(duì)形式存在于尿中［11］ .Ibu可減少氰酸鉀和半乳糖與晶體蛋白的結(jié)合量［2］ ，盡管Ibu和Para與晶體蛋白結(jié)合量小，但I(xiàn)bu的親水性較強(qiáng)，因而其結(jié)合緊密.酶學(xué)研究提示Ibu和Para無(wú)保護(hù)類(lèi)固醇誘導(dǎo)蘋(píng)果酸脫氫酶、氨甲酰化誘導(dǎo)6-磷酸葡糖酸脫氫酶和類(lèi)固醇誘導(dǎo)過(guò)氧化氫酶失活的作用，并可抑制延胡羧酸酶和3-磷酸甘油醛脫氫酶［10］ .但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究提示阿斯匹林類(lèi)藥物可防治白內(nèi)障，它們之間存在不同的保護(hù)機(jī)制，Ibu和Para可能是通過(guò)其藥物前體發(fā)揮作用.
α-晶體蛋白作為晶狀體主要的結(jié)構(gòu)蛋白，其分子 伴侶活性表現(xiàn)為在其他蛋白處于易感狀態(tài)時(shí)，可保護(hù)它們免受損傷，主要是抑制各種蛋白質(zhì)的凝聚和失活.目前認(rèn)為α-晶體蛋白為非對(duì)稱(chēng)的環(huán)形四價(jià)聚合體，中央有較大的空洞，表面密度低.在空洞的內(nèi)或外表面，C-端序列和伸展性的變化是維持α-晶體蛋白伴侶活性的重要因素［10］ .本結(jié)果提示1分子的α-晶體蛋白可部分保護(hù)4分子的酯酶.特異性保護(hù)作用可能是通過(guò)酯酶或變性的酯酶進(jìn)入空洞中央，粘附于α-晶體蛋白的外表面而起作用.Harding［1］ 提出包括白內(nèi)障的一類(lèi)結(jié)構(gòu)性疾病具有相同的病因，就可能存在共同的治療方案.17項(xiàng)流行病學(xué)研究表明，若全部老年人應(yīng)用阿斯匹林類(lèi)抗炎藥物，約50.0%的Alzheimer’s病可預(yù)防.因而阿斯匹林類(lèi)藥物，具有潛在的治療白內(nèi)障和Alzheimer’s病等結(jié)構(gòu)性疾病的作用.
致 謝 英國(guó)牛津大學(xué)眼科醫(yī)院Shyadehi AZ和Harding JJ對(duì)本研究給予幫助.
參考文獻(xiàn):
［1］Harding JJ.Cataract，Alzheimer’s disease，and other conforma-tional disease ［J］.Curr Opin Ophthal，1998;9（1）:10-13.
［2］Harding JJ.Cataract:Biochemistry，epidemiology and pharma-cology M］.London:Chapman&Hall，1991:219-249.
［3］Yan H，Zhang DG，Yang XG.The effects of aspirin-like drugs on prevention of cataract ［J］.Zhongguo Shiyong Yanke Zazhi（Chin J Pract Ophthalmol），1999;17（10）:236-238.
［4］Solerte SB，Invernizzi R，F(xiàn)ioravanti M，Schianca GC，Bozzetti A，Girino M，Bertolino G，F(xiàn)errari E.Cytochemistry of circula-ting lymphocytes in diabetes mellitus with and without retinopa-thy and in newly diagnosed type I（insulin dependent）diabetes ［J］.Acta Histochem，1986;80（3）:225-234.
［5］Agarwal VR，Rastogi AK，Sahib MK，Sagar P.In vitro insulin effect on acetylcholine esterase of erythrocyte membranes of nor-mal and diabetic rats ［J］.Acta Diabetol Lat，1985;22（4）:359-363.
［6］Kamei A.Properties of partially purified esterase in human crys-tallin lens and variation in its enzyme activity during aging and with advance of senile cataract ［J］.Biol Pharm Bull，1996;19:1223-1226.
［7］Yan H，Harding JJ.Inactivation and loss of antigenicity of es-terase by sugars and a steroid ［J］.Biochim Biophys Acta，1999;1454（3）:183-190.
［8］Shyadehi AZ，Harding JJ.Synthesis of tritium-labelled metabo-lites of ibuprofen ［J］.J Labelled Cpd Radiopharm，1999;42（3）:207-213.
［9］Derham BK，Harding JJ.The effects of ageing on the chaper-one-like function of humanα-crystallin assessed by three meth-ods ［J］.Biochem J，1997;328（8）:763-768.
［10］Hook DWA，Harding JJ.Protection of enzymes byα-crystallin acting as a molecular chaperone ［J］.Int J Biol Macromol，1998;22（3）:295-306.
［11］Davies NM.Clinical pharmacokinetics of ibuprofen.The first30years ［J］.Clin Pharmacokinet，1998;34（2）:101-154.
【阿斯匹林類(lèi)藥物和α┐晶體蛋白保護(hù)酯酶的失活】相關(guān)文章：
生物酶和化學(xué)助劑相結(jié)合的酶氧前處理新工藝11-19
他汀類(lèi)藥物與貝特類(lèi)藥物聯(lián)合應(yīng)用安全性探析03-01
干擾素-α上調(diào)肝癌細(xì)胞胸苷磷酸化酶增強(qiáng)氟尿嘧啶類(lèi)藥物敏感性的03-08
愛(ài)福丁農(nóng)藥中毒膽堿酯酶下降與臨床癥狀相關(guān)性分析-臨床醫(yī)學(xué)論文03-08
探究酶量加倍后酶動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)的變化12-07
甲基叔丁基醚催化劑失活原因及延長(zhǎng)策略02-21
IPM驅(qū)動(dòng)和保護(hù)電路的研究03-20
活教育和幼兒園紙藝論文02-21
他汀類(lèi)藥物與心肌缺血再灌注損傷03-01