淺談高效液相色譜法測(cè)定白花蛇舌草中槲皮素的含量
【摘要】 目的 建立高效液相色譜法測(cè)定白花蛇舌草中槲皮素含量的方法。方法 采用Hypersil BDS C18色譜柱(4.6 mm×200 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇?水?磷酸(體積比50∶50∶0.2) ，檢測(cè)波長(zhǎng)為370 nm。結(jié)果 槲皮素在0.08～ 0.32 μg 的范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系(r=0.999 6)，平均加樣回收率為101.5%，RSD為0.8%(n=6)。結(jié)論 本法快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可用于測(cè)定白花蛇舌草中槲皮素的含量，為評(píng)價(jià)白花蛇舌草的內(nèi)在質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】 白花蛇舌草 槲皮素 含量測(cè)定 高效液相色譜法
Abstract:Objective To determine the content of quercetin in Hedyotis diffusa Willd. Methods The analysis was performed on an HPLC C18 column (4.6 mm×200 mm，5 μm) at the detection wavelength of 370 nm. The mobile phase consisted of 0.2% phosphoric acid?methanol (50∶50) with a flow rate of 1 mL/min. Results The calibration curve was linear in the range of 0.08-0.32 μg of quercetin (r=0.999 6).The average recovery was 101.5% with RSD 0.8% (n=6).Conclusion The method is simple，rapid and accurate for the determination of quercetin in Hedyotis diffusa Willd, which could be used for the quality control of Hedyotis diffusa Willd.
Key words:Hedyotis diffusa Willd.; quercetin; HPLC
白花蛇舌草為茜草科植物白花蛇舌草(Hedyotis diffusa Willd.)的干燥全草，研究表明該植物主要含有黃酮類、三類、蒽醌類、環(huán)醚苷類、甾醇類、烷烴類等化學(xué)成分，具有抗肝炎、抗腫瘤、抗病毒、抗炎抑菌、降血脂及降血糖等多種藥理活性[1]。白花蛇舌草中黃酮類化合物的含量測(cè)定未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，本文采用HPLC法測(cè)定了白花蛇舌草中槲皮素的含量，為評(píng)價(jià)白花蛇舌草的內(nèi)在質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。
1 儀器與藥品
高效液相色譜儀：P230高壓恒流泵/DAD230二極管陣列檢測(cè)器(大連依利特分析儀器有限公司)，Hypersil BDS C18色譜柱(4.6 mm×200 mm，5μm，大連依利特分析儀器有限公司);電子精密天平(Ohaus);KS?1500超聲清洗器(寧波科勝儀器廠);高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)。
白花蛇舌草(市售，批號(hào)2006001，2006002，2006003)，經(jīng)本校藥植教研室陳再興老師鑒定均為白花蛇舌草(Hedyotis diffusa Willd.);槲皮素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)100081-200406，供含量測(cè)定用);甲醇為色譜純;水為重蒸水。
2 結(jié)果與分析
2.1 色譜條件
色譜柱：Hypersil BDS C18色譜柱(4.6 mm×200 mm，5 μm)，流動(dòng)相：甲醇?水?磷酸(體積比50∶50∶0.2);檢測(cè)波長(zhǎng)：370 nm，流速：1 mL/min，柱溫：25 ℃ ，進(jìn)樣量：20 μL。色譜圖見(jiàn)圖1、2。
2.2 對(duì)照品溶液的制備
精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥過(guò)夜的槲皮素對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含槲皮素10 μg的溶液，即得。
3 樣品溶液的制備
取白花蛇舌草藥材粗粉1.0 g，精密稱定，置燒瓶中，精密加入50%(體積分?jǐn)?shù))甲醇20 mL和鹽酸1 mL，密塞，稱定重量，加熱回流2 h，放冷，用50%(體積分?jǐn)?shù))甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜 (0.45 μm) 濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。
2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)
分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液各20 μL進(jìn)樣測(cè)定，理論塔板數(shù)為15 000，供試品溶液色譜圖中槲皮素峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度大于1.5。
2.5 線性關(guān)系的考察
精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥過(guò)夜的槲皮素對(duì)照品10.0 mg，加甲醇定容至100 mL，分別精密量取上述對(duì)照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL 置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成系列濃度的溶液。分別精密吸取各溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以槲皮素峰面積(A)為縱坐標(biāo)，槲皮素進(jìn)樣量(m)為橫坐標(biāo)，繪制準(zhǔn)曲線，得回歸方程為 A=274.79m+54.43，r=0.999 6，結(jié)果表明槲皮素在0.08～0.32 μg范圍內(nèi)與峰面積成良好線性關(guān)系。
2.6 精密度試驗(yàn)
取槲皮素對(duì)照品溶液20 μL ，重復(fù)進(jìn)樣6次分別測(cè)定峰面積為2 949，2 911，2 891，2 946，2 950，2 957， RSD為0.9%(n=6)，結(jié)果表明精密度良好。
2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)
取供試品溶液(批號(hào)2006001)，分別在2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣，測(cè)得槲皮素峰面積為1 437，1 422，1 451，1 430，1 421，1 425，RSD為0.8%，結(jié)果表明供試樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.8 重現(xiàn)性試驗(yàn)
取同一批號(hào)的白花蛇舌草5份，按“2.3”制備樣品溶液，進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得槲皮素的峰面積為1 447，1 452，1 425，1 419，1 423，RSD為1.1%(n=5)，結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性良好。
2.9 回收率試驗(yàn)
精密稱取已知含量的白花蛇舌草(批號(hào)2006001)5份，分別加入槲皮素對(duì)照品適量，按“2.3”制備供試品溶液，測(cè)定含量，結(jié)果測(cè)得回收率101.8%，102.4%，101.9%，101.1%，100.4%，平均值為101.5%;RSD為0.8%。
2.10 樣品測(cè)定
分別取白花蛇舌草藥材3批(批號(hào)2006001，2006002，2006003)，按“2.3”制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果測(cè)得槲皮素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為：0.091 3，0.085 7和0.088 0 mg/g。
3 討 論
3.1 文獻(xiàn)報(bào)道槲皮素的檢測(cè)波長(zhǎng)為360nm[2,3]、254 nm[4] 、368 nm[5]，本文利用DAD二極管陣列檢測(cè)器對(duì)槲皮素對(duì)照品進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果最大吸收峰為370.2 nm，故選擇370 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，見(jiàn)圖3。
3.2 實(shí)驗(yàn)考察了不同比例的甲醇?水為流動(dòng)相，最后確定流動(dòng)相為甲醇?水?磷酸(體積比50∶50∶0.2)，柱溫25 ℃，流速1 mL/min，樣品中槲皮素達(dá)到良好的分離。
3.3 白花蛇舌草中黃酮類化合物的含量測(cè)定未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，本文采用高效液相色譜法測(cè)定了白花蛇舌草藥材中槲皮素的含量，操作簡(jiǎn)便、快速，可作為白花蛇舌草質(zhì)量控制的有效手段。
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