牙本質涎磷蛋白G0代轉基因小鼠的獲得
Generation of transgenic mouse founders of DSPP
【Abstract】 AIM: To establish tetracyclineresponsive regulated transgenic mice of dentin sialophosphoprotein (DSPP). METHODS: DSPP coding sequence was contained in plasmid pBluescriptDSPP and the transgenic vector was constructed by subcloning it into pTRE2 by NotI/SalI digestion. Following identification by enzyme digestion and sequencing, the final plasmid was named pTRE2DSPP. After linearized by XhoI and recovery, the plasmid was microinjected into the male pronucleus of the zygotes and the zygotes in good condition were implanted into pseudopregnant mice. The tail DNA of 3 weekpups was tested by PCR and Southern blot. RESULTS: Six hundred and fiftyseven embryos were implanted to 28 recipient pseudopregnant mice, with 6 of the 85 pups carrying the transgene. The establishment of the transgenic line progressed from the 6 positive ones. CONCLUSION: The founders of the tetracyclineresponsive regulated transgenic mice of DSPP are established successfully.
【Keywords】 tooth; dentin sialophosphoprotein; mice, transgenic; microinjections
【摘要】 目的： 構建四環素調控性牙本質涎磷蛋白（DSPP）轉基因體系中的受控小鼠系. 方法： 從質粒pBluescriptDSPP中，將小鼠DSPP編碼序列亞克隆到pTRE2的NotI/SalI位點間，構建轉基因載體，經酶切鑒定和測序確認后，命名為pTRE2DSPP；將XhoI酶切線性化的載體DNA純化后，顯微注射到小鼠受精卵的雄原核中，挑選生長狀態好的受精卵，移植到假孕母鼠的輸卵管. 仔鼠出生3 wk后，用PCR及Southern Blot檢測陽性小鼠. 結果： 注射的受精卵共存活657枚，移卵至28只假孕母鼠后，產仔85只，PCR檢測10只為陽性，Southern Blot檢測6只為陽性. Southern Blot檢測陽性小鼠分別傳代，開始建系. 結論： 顯微注射方法獲得了DSPP轉基因受控小鼠的G0代.
【關鍵詞】 牙；牙本質涎磷蛋白；小鼠轉基因；微量注射
0引言
牙本質涎磷蛋白是成牙本質細胞和牙髓干細胞的標志性蛋白［1，2］. 為動態地研究DSPP在牙齒發育、礦化不同階段的作用，以及對機體其他器官的可能影響，我們首先用顯微注射法獲得了G0代DSPP轉基因小鼠.
1材料和方法
1.1材料
質粒pTRE2, pBluescriptDSPP為中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所基因工程組保存或構建；PCR試劑盒購自Takara公司（日本），限制性內切酶、連接酶、隨機引物DNA標記試劑盒購自New England Biolabs公司（英國），凝膠DNA純化試劑盒、質粒DNA大量抽提試劑盒購自Qiagen公司（德國），蛋白酶粉劑購自華美公司（中國），雜交液ExpressHyb Hybrization Solution購自Clontech公司(美國)，引物由申友公司（中國）合成.
儀器包括Leica顯微操作儀，PerkinElmer PE9700型PCR儀，BioRad SmartSpec 3000 紫外分光光度計， GIS凝膠圖像處理系統. 4 wk以上性成熟SPF級B6CBA/F1（為CBA♂鼠與C57BL/6J♀鼠雜交F1代）小鼠，由上海南方模式生物研究中心SPF級動物房提供.
1.2方法
質粒pBluescriptDSPP 先PvuI酶切，然后NotI/SalI酶切，可獲得含DSPP編碼序列的片段（約3.0 kb）,與經過NotI/SalI酶切的線性化pTRE2于16℃連接過夜；轉化，挑克隆NotI/SalI酶切鑒定，序列測定，命名為pTRE2DSPP. XhoI酶切線性化，電泳回收，-20℃保存備用. 供卵鼠于明暗循環的明循環中點ip孕馬血清（PMS）10 IU, 46 h后注射HCG 10 IU，并與公鼠合籠，次日晨將有陰栓的母鼠處死. 取輸卵管在膨大部劃出卵團，加透明質酸酶消化，挑出受精卵于M16繼續培養4 h.
在水平拉針儀（Model PN30）上將顯微注射GD1管拉成注射針，注射針末端虹吸DNA溶液后，于400倍鏡下注入受精卵雄原核.
注射后在M16繼續培養2~4 h，挑選生長狀態好的卵移卵，每只假孕鼠輸卵管單側移卵25~30枚. 注射的受精卵共存活657枚，移卵后產仔85只. 待小鼠3 wk后剪取鼠尾1 cm，加500 μL裂解液，50 μL蛋白酶K，56℃消化過夜. 離心，無水乙醇沉淀，700 mL/L乙醇洗滌，干燥后溶解于200 μL 純水中，紫外分光光度計定量.
轉基因陽性鼠. 反應條件： 95℃預變性5 min；94℃變性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸3 min，35個循環；72℃延伸10 min.
Southern雜交： 選PCR陽性者，各取DNA 30 μL（約15 μg），用EcoRI消化，電泳，變性，中和，轉膜，紫外交聯，即可行雜交，探針為以顯微注射用DNA為模板、以P1、P2為引物所獲得的DSPP cDNA 段片.
G0代整合小鼠每只一籠飼養，后與C57小鼠配種，雌性1∶1，雄性1∶2. F1代整合小鼠每系取雄性： 雌性1∶1~3合籠，F2代即可行純合子鑒定. 建系同時對小鼠進行大體觀。
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