關(guān)于泡盛曲霉生成酸性蛋白酶調(diào)節(jié)問題的研究
對(duì)于微生物細(xì)胞所分泌的酶的形成物的調(diào)節(jié)，可按負(fù)反饋原理進(jìn)行。曾發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中則含有這些酶類，如黃曲霉(Aspergillusoryzae)的a一淀粉酶。隨后又確定，用同樣的方法，又發(fā)現(xiàn)在酵母機(jī)體中對(duì)所分泌的日一果糖普酶(轉(zhuǎn)化酶)的形成物具有調(diào)節(jié)作用。根據(jù)這種調(diào)節(jié)機(jī)理可以闡明許多特性，其結(jié)論是:這種調(diào)節(jié)原理應(yīng)進(jìn)一步加以擴(kuò)展。本文提供這樣的結(jié)果，即可斷定，當(dāng)培養(yǎng)基中含有蛋白酶時(shí)，對(duì)Aspergillusawan:。ri所分泌的蛋白酶的形成物，存在著調(diào)節(jié)作用。關(guān)于這點(diǎn)早已有所報(bào)導(dǎo)。
試驗(yàn)是用AspergilluSawamori78一2的培養(yǎng)物進(jìn)行的。這一菌株是由C.A.卡諾凡洛夫(C.A.KoH。:a二oB)和T.B.沙霍夫(T.B.山。xoB)分離而得的。所產(chǎn)生的蛋白酶(np0Tea3a，阮酶)，實(shí)際上是一種酸性蛋白酶，其能大量地產(chǎn)生這種酶。
霉菌培養(yǎng)在1升中含有如下成分的培養(yǎng)基質(zhì)中，其配方為:磷酸二氫鉀一5克，硫酸鎂一20毫克，硫酸鋅一20毫克，硫酸鐵一20毫克，黑麥粉提出液(在200毫升水中加入20毫克麥粉，在溫度+2“c的條件下經(jīng)17小時(shí)，然后經(jīng)離心分離而制得)，PHS。6，應(yīng)當(dāng)指出:在培養(yǎng)基的條件中，特別重要的是蛋白質(zhì)的含量，為此，在研究工作中特別要選擇這樣的方法，即使其保證在無(wú)抑制的條件下大量地形成蛋白酶，而蛋白酶則由蛋白分解物而合成。菌種培養(yǎng)在麥芽汁一瓊脂培養(yǎng)基上，系用胞子懸浮液進(jìn)行接種。培養(yǎng)物放置在搖床上(溫度26OC)，在通氣的條件下培養(yǎng)一晝夜。
對(duì)培養(yǎng)液和菌絲體中的蛋白酶活性進(jìn)行了測(cè)定。后者與玻璃粉一道研磨2分鐘，并在室溫下浸泡一小時(shí)。測(cè)定活性系按研究誘發(fā)變異方面的M.阿恩沙(M.AHCOH)的方法、T.B.沙霍夫和C.A.卡諾凡洛夫的方法而進(jìn)行的。其利用溶解在PHI.9的鹽酸甘油緩沖液中的公牛血紅蛋白(BH:二達(dá)FeMoT二。6oH)而作為培養(yǎng)基質(zhì)的。反應(yīng)過的混合物PH2.3。其在適當(dāng)?shù)幕|(zhì)濃度和控制地加入兩倍體積的5%三氯乙酸的條件下，按初速狀態(tài)進(jìn)行反應(yīng)。活性是按1克菌絲體中所形成的酪氨酸(Topo3oH)的數(shù)量(按毫克計(jì))而表示的。
在上述條件下，為了弄清楚當(dāng)培養(yǎng)基中存在過量的酶制劑時(shí)對(duì)細(xì)胞分泌酶形成物的壓抑作用，可在接種前將從同類試物中分離出來(lái)的酶制劑加入培養(yǎng)基中，這樣使其建立具有一定濃度蛋白酶的條件。
作者曾由培養(yǎng)在含有黑麥粉(2%)培養(yǎng)基中的Aspergillusawamori78一2培養(yǎng)液中制取了酸性蛋白酶制劑。試驗(yàn)的程序也正如以前所敘述過的那樣，提出了三個(gè)方案:
l)加入酶制劑的原始培養(yǎng)基;
2)在這種培養(yǎng)基上所得的霉菌培養(yǎng)物;
3)未加入酶制劑的霉菌培養(yǎng)物。
為了探索調(diào)節(jié)因子的作用界限，則將酶制劑按不同濃度加入培養(yǎng)基中。酶的水溶液則通過細(xì)菌過濾器進(jìn)行消毒。在試驗(yàn)過程中，向培養(yǎng)基中所加的酶活性和培養(yǎng)基的PH是不變的。在不同的試驗(yàn)方案中培養(yǎng)物的生長(zhǎng)情況，均未發(fā)現(xiàn)異常現(xiàn)象。
在表中列出了典型試驗(yàn)的結(jié)果。由表可見，培養(yǎng)基中的酶對(duì)于酶分泌物的形成顯示著一定的壓抑作用。培養(yǎng)基中蛋白酶濃度愈高，那末，細(xì)胞形成物在更大程度上處于受壓抑的地位。壓抑僅屬于酶的分泌部份。在某種條件下，而細(xì)胞中蛋白酶活性的水平甚至還會(huì)提高一些。但是，這一提高遠(yuǎn)不能補(bǔ)償酶分泌部份因活性的受壓抑所遭的損害。!二述現(xiàn)象，即復(fù)現(xiàn)了在研究其它試驗(yàn)物時(shí)早就揭示的規(guī)律性。
[1]
在以前的研究中已獲得大量數(shù)據(jù)，研究所得的效應(yīng)可視為調(diào)節(jié)原理。并確定，培養(yǎng)基中所具有的活性酶就是調(diào)節(jié)因子。H.C.依加洛夫(H.C.EropoB)及其同事們對(duì)具有水解能力的色氏菌(Serratiamarcesce。)所分泌的蛋白酶的詳盡的調(diào)節(jié)機(jī)理進(jìn)行了深入探討。
從所進(jìn)行的一系列對(duì)照試驗(yàn)中，其使我們深信，在上述的因子中，我們找到了在培養(yǎng)基中含有調(diào)節(jié)因子對(duì)培養(yǎng)物分泌酶的調(diào)節(jié)作用的新例證。而沒有可仿造的這種規(guī)律性的任何的其它現(xiàn)象，首先必須弄清楚，在我們的條件下，尚沒有產(chǎn)生蛋白分解產(chǎn)物對(duì)蛋白酶形成物的壓抑。而壓抑是在向培養(yǎng)基中加入酶制劑的作用條件下形成的。在試驗(yàn)中曾向培養(yǎng)基中加入了由Aspergillusawamori78一2所得蛋白酶制劑的最大劑量(2毫克)。在同樣的條件下，在任何培養(yǎng)物中均可培育出這種反應(yīng)混合物。當(dāng)加熱使酶鈍化后，再將抱子接入這種培養(yǎng)基中。試驗(yàn)結(jié)果指出:無(wú)論在培養(yǎng)基中或菌絲體中的酶活性均不可能優(yōu)于將霉菌培養(yǎng)在無(wú)酶制劑的條件下所獲得的酶活性。
因此，在我們所進(jìn)行的試驗(yàn)中，在具有蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基中，對(duì)于其降解產(chǎn)物蛋白酶的形成方面，并沒有出現(xiàn)壓抑作用。顯然，這應(yīng)該這樣解釋，即具有壓抑性質(zhì)的蛋白分解產(chǎn)物的濃度，在我們的試驗(yàn)條件下，并沒有達(dá)到真正的界限數(shù)值。根據(jù)所得數(shù)據(jù)可得出這樣的結(jié)論:由于加熱而遭鈍化的酶，對(duì)于霉菌細(xì)胞的酸性蛋白酶的形成并不起壓抑作用。關(guān)于這一點(diǎn)，在將鈍化過的酶加入原始培養(yǎng)基的試驗(yàn)中得到了證實(shí)。
此外，在試驗(yàn)過程中，我們還就霉菌生命活動(dòng)的產(chǎn)物或培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)被自身酶分解所得產(chǎn)物對(duì)被加入培養(yǎng)基中的蛋白酶鈍化與否的可能性進(jìn)行了驗(yàn)證。假如發(fā)生這樣的鈍化作用，那末就可摹擬在霉菌細(xì)胞繼續(xù)分泌的條件下對(duì)酶形成物的壓抑作用。試驗(yàn)結(jié)果指出:上述的因子并不影響酶活性。在我們的試驗(yàn)條件下，以及在原始培養(yǎng)基中培育酶的條件下，酸性蛋白酶同樣是不變化的。
最后，可以設(shè)想，由于摹擬形成物的壓抑作用而被霉菌細(xì)胞鈍化吸附的結(jié)果，所加入的酶活性會(huì)有所降低。大家知道，活細(xì)胞具有吸離培養(yǎng)基中酶的能力，而同樣在吸離作用條件下，也會(huì)失去酶活性。我們?cè)_定，Aspergillusawamori78一2的細(xì)胞并不能吸住從這種霉菌培養(yǎng)物中所獲得的大量的酸性蛋白酶(按活性計(jì))從所列舉的上述因子指出:在我們的試驗(yàn)條件下，無(wú)論在本身培養(yǎng)基因子的影響下，也無(wú)論在細(xì)胞作用于所具有的酶的影響下，培養(yǎng)基中的酸性蛋白酶的活性都是不會(huì)降低的。在蛋白分解產(chǎn)物的影響下或在霉菌生命活動(dòng)過程中所積累的其它產(chǎn)物的影響下，同樣也不會(huì)發(fā)生對(duì)酶細(xì)胞形成物的壓抑作用。這樣，若存在于墻養(yǎng)基中的Aspergillusawamori78一2所具有的本身的活性的酸性蛋白酶的濃度超過了極限，則霉菌細(xì)胞會(huì)對(duì)這種酶的形成起著壓抑作用。根據(jù)所得的結(jié)果與原先發(fā)表的資料進(jìn)行對(duì)照的同時(shí)，可以得出結(jié)論:上述的因子是在培養(yǎng)基中所含有的酸性蛋白酶按照反饋原理，對(duì)分泌酶的形成物調(diào)節(jié)的新條件。
[2]
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